选对Western Blot内参抗体,实验成功一半!

2022-04-21

WB为什么必须要用内参?

要检测一个基因是否有表达,或者比较表达水平的变化,首选方式是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单,既可以定性分析表达产物,还可以检测目的蛋白量的相对变化。在实验中,可能存在总蛋白浓度测定不准确,或者蛋白质样品在上样时产生的操作误差。特别表达量不高时,蛋白定量或上样的误差很有可能影响结果的分析。

为了校正这个误差,Western Blot实验都需要进行内参检测。具体校正方法就是将每个样品目的含量与内参含量相除,得到每个样品目的蛋白的相对含量。再进行样品与样品之间的比较。

如何选择内参?

内参抗体种类很多,比如β-actin、β-tubunlin、GAPDH、Lamin B等,那么针对自己的实验,我们该如何选择呢?下面简单介绍下选择内参抗体应遵循的原则:

1.样本种属来源

首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。

(1)哺乳动物的组织或者细胞样本,通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na,Katpase等。

(2)植物来源实验样本,则可以选择plant actin、Rubisco等。

(3)其他来源样本研究较少,所以就应该参照文献报导,选择合适的蛋白作为内参。

2.目的蛋白分子量

选择内参抗体时,应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如目的蛋白分子量为45KD,此时不适宜选择β-actin作为内参,可以考虑选择GAPDH或者β-tubulin作为内参。

3.目的蛋白表达部位

就一般的蛋白检测来说,β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了,而针对于核蛋白的定量,特别是样本蛋白就是核蛋白时,选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3,除此之外,其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等,在一些文献报道中,Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测,常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测,常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。

常用三大内参

1.beta Actin

肌动蛋白,细胞骨架蛋白。它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。beta Actin 作为内参是得到公认的,针对大多数组织和细胞来说的,它广泛分布于细胞质内,表达量非常丰富。但是在一些少量特殊的情况下比如脂肪组织和细胞内,beta Actin 的表达量就很少。

2.GAPDH

甘油醛-3-磷酸脱氢酶,该酶是糖酵解反应中的一个酶,几乎在所有组织细胞中都高水平表达,在同种细胞或组织中的表达量一般是恒定的,且很少受外部诱导物的影响。但比如缺氧和糖尿病等疾病存在下,会增加 GAPDH 在特定细胞和组织中的表达。

3.beta Tubulin

微管蛋白,细胞骨架蛋白。作为内参抗体,beta Tubulin 表达通常不会发生改变,因此被广泛用于 Western Blot 内参,也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

内参使用注意事项

▲1. 不同的内参在选择上也要根据具体的样本情况选择,没有一种内参能适用所有的组织和细胞样本。比如,血红细胞(因为其细胞结构的特殊性和需要携带氧气的功能性)样本就不适合以上 3 种常用内参。如果使用会导致结果很差或者没有结果。可以选用血红细胞的结构性蛋白作为内参代替。

▲2. 在做多组织多细胞样本对比表达量时,最好选用 GAPDH 作为内参,因为 GAPDH 是代谢类蛋白,在活组织中表达比较恒定。而 beta Actin 和 beta Tubulin 是结构蛋白,不同组织的细胞结构会有差异性,如脑组织的 tubulin 的表达会高一些(因为神经细胞的轴突和树突都由 tubulin 维持结构),而 actin 的表达量可能会低一些。再比如,骨骼肌、心肌和平滑肌的特殊功能反而导致了 tubulin 的表达改变和特化。心肌的 beta Actin 的表达量可能变少,而 alpha Actin 表达量高。因为这些组织的差异,现在慢慢采用总 Actin 和总 tubulin 作为内参,可以尽量减少一些组织表达量差异。

▲3. 做各种分泌液样本的时候,如血浆,乳汁,组织液等,以上的 3 种内参也不是很合适。由于没有完整的细胞结构,所以只能选择一些分泌蛋白作为内参,或者采用其他方式作为内参。

▲4. 做诱导后样本或检测磷酸化等修饰性抗体时,选择结构蛋白作为内参,如 beta Actin 和 beta Tubulin。因为 GAPDH 是代谢类蛋白,表达量有可能会受到诱导处理的影响。同时,做修饰性抗体的 Western Blot 实验,最好也带上同抗原的总抗作为阳性对照。

▲5. 做 Western Blot 实验时,内参的条带强度也要适当控制。不要让内参条带发生过度曝光的情况,尤其是用 X 胶片曝光的。如果内参条带过度曝光,条带会显得很宽,妨碍对条带正确强度的判读,进而影响对其他实验结果的判断。最好的内参结果是: 窄窄的,黑色实心条带。

的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

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