PCR 可能是分子生物学中使用最广泛的技术。虽然我本科学的是生物科学，提过DNA，也跑过 PCR，但现在都快忘了 PCR 的步骤是三个还是四个了。赶快⽹络搜索之，整理成⼀个从零开始学系列。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是⼀项利⽤ DNA 双链复制原理，在⽣

物体外复制特定 DNA ⽚段的的核酸合成技术。可在短时间内⼤量扩增⽬的 DNA ⽚段，⽽不必

依赖⼤肠杆菌或酵母菌等⽣物体。

DNA 的半保留复制是⽣物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种酶的作⽤下可以变性解旋

成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分⼦拷贝。在实验中

发现，DNA 在⾼温时也可以发⽣变性解链，当温度降低后⼜可以复性成为双链。因此，通过温

度变化控制 DNA 的变性和复性，加⼊设计引物，DNA 聚合酶，dNTP 就可以完成特定基因的

体外复制，这是 PCR 的理论基础。

⼀、反应体系

PCR 反应是在体外模拟 DNA 的复制过程，因此反应体系中必须具有 DNA 复制所需的基本要

素：

1. 模板（template），含有需要扩增的 DNA ⽚段。

2. 引物（primer），⼀对引物决定了需要扩增的起始和终⽌位置。

3. 聚合酶（polymerase ），DNA 聚合酶复制需要扩增的区域。

4. 脱氧核苷三磷酸（dNTP），⽤于构造新的互补链。

5. 缓冲液（buffer），提供适合聚合酶⾏使功能的化学环境。

⼆、反应步骤

标准 PCR 过程分为三步：

1. 变性（Denaturation）：利⽤⾼温使 DNA 双链分离。DNA 双链之间的氢键在⾼温下（93

- 98℃）被打断。

2. 退⽕（Annealing）：在 DNA 双链分离后，降低温度使得引物可以结合于单链 DNA 上。

3. 延伸（Extension）：DNA 聚合酶由降温时结合上的引物处开始沿着 DNA 链合成互补

链。延伸完成，则完成⼀轮循环，DNA ⽚段数增加⼀倍。往复循环这三个步骤 25-35

次，DNA ⽚段数将得到指数级增加。

聚合酶链式反应简图

三、结果检测

PCR 反应扩增出了⾼的拷贝数，下⼀步检测就成了关键。荧光素（溴化⼄锭，EB）染⾊凝胶电

泳是最常⽤的检测⼿段。电泳法检测特异性是不太⾼的，因此引物两聚体等⾮特异性的杂交体

很容易引起误判。但因为其简捷易⾏，成为了主流检测⽅法。近年来以荧光探针为代表的检测

⽅法，有逐渐取代电泳法的趋势。

四、技术特点

1. 灵敏度⾼

-12

PCR 产物的⽣成量是以指数⽅式增加的，能将⽪克（pg = 10

）量级的起始待测模板扩

增到微克（µg=-6）⽔平。能从 100 万个细胞中检出⼀个靶细胞；在病毒的检测中，PCR

的灵敏度可达 3 个 RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最⼩检出率为 3 个细菌。

2. 特异性强

CR 反应的特异性决定因素：

引物与模板 DNA 特异正确的结合；

碱基配对原则；

Taq 聚合酶合成反应的忠实性；

靶基因的特异性与保守性。

3. 简便、快速

只需要⼀次性将反应液加好后，就可以进⾏扩增。⼀般 2~4 ⼩时完成扩增反应。扩增产物

⼀般⽤电泳分析，不⼀定要⽤同位素，⽆放射性污染、易推⼴。

4. 纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及 RNA 均可作为扩增模板。可直接⽤临

床标本如⾎液、体腔液、洗漱液、⽑发、细胞、活组织等 DNA 扩增检测。

五、发展历史

1971 年，Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想：经 DNA 变性，与合适的引物杂交，⽤

DNA 聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成 tRNA 基因。但由于当时基因序列分析⽅法

尚未成熟，热稳定 DNA 聚合酶尚未报道以及引物合成困难，这种想法似乎没有实际意义。

1983 年，Kary Mullis ⾸先提出设想。

1985 年，Kary Mullis 在 Cetus 公司⼯作期间，发明了 PCR，即简易 DNA 扩增法。

1985 年 10 ⽉ 25 ⽇申请了 PCR 的专利，1987 年 7 ⽉ 28 ⽇批准，Mullis 是第⼀发明⼈。

1985 年 12 ⽉ 20 ⽇在 Science 杂志上发表了第⼀篇 PCR 学术论⽂，Mullis 是共同作者。

1986 年 5 ⽉，Mullis 在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习 PCR 的⽅法。

1988 年，Saiki 等将 Taq DNA 聚合酶⽤于 PCR 技术，成功完成了 DNA 的⾃动扩增。

1993 年 10 ⽉，Kary Mullis 获得了诺贝尔化学奖。

从 PCR 技术发明⾄今已过 30 年，技术迭代已到第三代，在过去的 30 年⾥ PCR 技术为⽣命科

学的发展做出了不可磨灭的贡献。

⼀代 PCR

第⼀代 PCR 技术就是最初的 PCR，采⽤普通 PCR 扩增仪来对靶基因进⾏扩增，然后采⽤琼脂

糖凝胶电泳对产物进⾏检测，只能做定性分析。

1. 技术应⽤

能将微量的 DNA ⼤幅增加。因此对化⽯中的古⽣物残骸，犯罪现场的⽑发、⽪肤碎屑或⾎液，

只要能分离出⼀丁点的 DNA，就能⽤ PCR 加以放⼤，进⾏⽐对。

2. 技术优势

灵敏度⾼，特异性强，简单快捷，对样品的纯度要求低等。

3. 技术缺点

最初的 PCR 技术所采⽤的核酸染料，会对实验⼈员和环境造成伤害

PCR 完成之后需要开盖检测，容易发⽣污染造成假阳性结果

检测耗时长，操作⿇烦，容易出错

只能做定性检测

⼆代 PCR

第⼆代 PCR 就是荧光定量 PCR 技术（Real-Time PCR），也叫做 qPCR。荧光定量 PCR 通

过在反应体系中加⼊能够指⽰反映进程的荧光探针，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积

累。通过荧光曲线来判断结果，并可以借助 Cq 值和标准曲线来定量。

1. 技术应⽤

⽤于传染性疾病病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核，遗传疾病诊断。

2. 技术优势

污染风险低

操作流程更简单、经济⾼效

需要的 DNA 和 RNA 加样量少

3. 技术缺点

不同⼚家⽣产的试剂和设备所产⽣的 Cq 值之间存在⼀定的差异，并不具备可⽐性

存在背景值的影响，结果易产⽣偏差

对于低拷贝的 DNA 往往难以检测

当反应体系中有 PCR 抑制物存在时，常规的 PCR 体系经常会受到影响

三代 PCR

第三代 PCR 技术叫做数字 PCR（Digital PCR, dPCR, Dig-PCR），这是⽬前全新的⼀种 PCR

检测⽅式，能对核酸进⾏检测和定量，采⽤直接计数⽬标分⼦⽽不依赖任何校准物或者外标，

即可确定低⾄单拷贝的待检靶分⼦的绝对数⽬。

1. 技术应⽤

⽤于⼤量正常细胞群中检测少数含突变的细胞。通过稀释样品 DNA 到对应的检测孔中，经过

PCR 扩增之后，向每个孔⾥加⼊特异性荧光探针与产物杂交，然后直接计数样本中突变型和野

⽣型等位⼦的数量。

主要应⽤于突变分析、等位基因缺失、混杂 DNA 的癌症检测等等。

2. 技术优势

灵敏度更⾼

数字 PCR 将传统的 PCR 反应分割成了数万个体系，这些体系独⽴扩增，独⽴检测，保证了个

位数的模板数量都可以被检测到。

定量更准确

数字 PCR 通过微体系的荧光计数，直接将反应初始模板数量统计出来，即使某些微滴中的模板

数量不⽌⼀个，也可以通过泊松分布进⾏计算。

抗⼲扰能⼒更强

数字 PCR 第⼀步反应体系的分配过程中，会将模板和抑制物分配到不同的体系，降低抑制物的

⼲扰。并且，与 qPCR 不同的是，dPCR 检测的是终点荧光，即使微体系稍微受到了影响，也

不会影响最终结果的判读。

3. 技术缺点

模板质量要求较高

由于数字 PCR 将反应拆分成了数万个独⽴体系，因此其对模板量有⽐较⾼的要求，模板量超过

微体系量会导致⽆法定量，过少会导致信号过低，降低定量准确度。

⾮特异性产物的判断

数字 PCR 观测的是每个体系中的终点荧光，⽆论 PCR 产物是否是特异性产物，只要荧光信号

⾜够强，也是会判读为阳性结果。因此 dPCR 的引物特异性要求极⾼。

PCR 各种延伸技术

递减 PCR（touchdown PCR）：前⼏循环温度逐渐下降。

逆转录 PCR（RT-PCR）：以由mRNA逆转录⽽来的 cDNA 为模板，也因为是从表现型基因来

进⾏增量的，由此产⽣出来的 cDNA 产物不带有内含⼦（基因中不具意义的段落），常应⽤于

分⼦克隆技术。

热启动 PCR（hot start PCR）：以⾼热激活型核酸聚合酶进⾏反应，减少⾮专⼀性产物。

即时 PCR（real-time PCR）：PCR 过程中利⽤萤光探针或染料定量检测，⼜称定量

PCR（quantitative PCR），可以进⾏多组对⽐。

巢式 PCR（nested PCR）：先⽤低特异性引物扩增⼏个循环以增加模板数量，再⽤⾼特异性引

物扩增。

多重 PCR（multiplex PCR）：在同⼀个管中使⽤多组引物。

复原条件 PCR（reconditioning PCR）：PCR 产物稀释 10 倍后重新放⼊原浓度的引物和

dNTP 等循环 3 次，以消除产物中的异⼆聚体。

dsRNA 合成（dsRNA replicator）：合并使⽤ high-fidelity DNA polymersae、T7RNA 聚合酶

与 Phi6 RNA replicase；从双股 DNA 转录为对应的双股 RNA（dsRNA）。可应⽤于RNAi实验

操作。

COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature-PCR):⽤以检测突变或特殊等

位基因的 PCR 应⽤技术。

Digital-PCR：将标准的 PCR 反应分割⾄每⼀个反应中仅 1~2 个 copy。藉以侦测微⼩⽐例的基

因差异。应⽤于：癌症突变基因、病原体检测、借由母⾎对胎⼉做产前检测。

六、应⽤

感染性疾病

PCR 在医学检验中最有价值的应⽤领域就是对感染性疾病的诊断。理论上，只要样本中有⼀个

病原体存在，PCR 就可以检测到。⼀般实验室也能检出 10~100 基因拷贝。PCR 对病原体的检

测解决了免疫学检测的“窗⼝期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。

肿瘤

癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期和良性的阶段就可出现。PCR 技术不但能有效的检

测基因的突变，⽽且能准确检测癌基因的表达量，可据此进⾏肿瘤早期诊断、分型、分期和预

后判断。

遗传病

PCR 技术⾸次临床应⽤就是从检测镰状细胞和β-地中海贫⾎的基因突变开始的。基因的突变和

缺失均会引起各种珠蛋⽩的表达不平衡，⽤ FQ-PCR 检测各种珠蛋⽩基因表达差异，是地中海

贫⾎诊断的有效⼿段。

其他

PCR 技术还可以应⽤于⽣命科学的⽅⽅⾯⾯，⽐如：亲⼦鉴定，分析远古 DNA 等。

⼀点感想：任何⼀项技术都不是孤⽴发展的，需要其他技术的配合。PCR 技术也不

例外。虽然提出设想很早，但真正变成现实，也是在其他配套技术成熟后才实现

的，否则只是空想。

注：本⽂由⽹络资料整理⽽成。

后续更新计划，敬请期待吧：

从零开始学 PCR 技术（⼀）：PCR 技术简介

从零开始学 PCR 技术（⼆）：Ta