HiPure Yeast Plasmid Mini Kit

酵母高纯度质粒大量快速提试剂盒

酵母高纯度质粒大提试剂盒 核酸提取

目录号：31119-10

保存条件：

在室温(15~25℃)干燥条件下，可保存 12个月。加入RNaseA后的溶液P1应置于 2 ~ 8℃

保存，可稳定保存 6个月,如果 P1中 RNaseA失活，重新补加即可。

本试剂盒用于高纯度酵母质粒 DNA的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。

1.通常酵母的拷贝数都很低，高拷贝最大得率一般为每 5ml培养物提取 1μg左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为：1-5μl 用做 PCR模板;5-10μl用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。

2.用户需要自备Sorbitol buffer( 1M山梨chun， 0.1M Na2EDTA，14 mM β-巯基乙醇)。 配制方法：在600ml去离子水里面溶解182.2克山梨chun，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH8.0)，不需要调节PH值，定容到1L，4℃保存。临用前加0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)。

3.使用前请先检查平衡液、溶液 YP2和溶液 YP3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃

水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

4.溶液YP1，YP2和YP3的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；

一、第一次使用前请先在去蛋白液 PD、漂洗液 WB中加入指ding量无水乙醇（见瓶身标签），充分混匀，并做好标记，以免多次加入。

二、shou次使用时请先将 RNaseA全部加到溶液YP1中，混匀，每次使用后置于 2~8℃保存。三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

1.取 100- 180ml酵母培养物，12,000xg离心 1min，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

（注意： 如果用 50ml离心管收集菌体，可以离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，重复步骤

1，直到收集到足够多的菌体）

2.加入 10mlSorbitolbuffer，轻柔吹打充分重悬细胞；加入 0.1gLyticase (Lyticase临用前用 2mlSorbitolbuffer溶解)，充分颠倒混匀，37℃温育 1– 2小时消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

（注意：如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase消化的酵母可选用 Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。）

3.12,000xg离心 2min，尽可能吸弃上清，加入 7ml溶液YP1，重悬菌体沉淀，涡旋震

荡至che底悬浮。

（注意：如有未che底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

4.加入 7ml溶液YP2，温和地上下翻转 6-8次，使菌体充分裂解，室温放置 4min。

（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏，如未wan全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液 P2的用量，在后续的操作中溶液 YP3的用量也要相应增加）

5.加入 10ml溶液YP3，立即温和地上下翻转 6-8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，

然后室温 12,000xg离心 10-15min,小心取上清，避免吸到白色漂浮物。

（注意：加入溶液 YP3后应立即混合，避免产生 SDS的局部沉淀,如果上清中还有白色漂浮物，可再次离心取上清）

6.将上清液加入吸附柱中（吸附柱最大容量 10ml），室温 12,000rpm离心 1min，质粒被

吸附在膜上，弃滤液。重复步骤直到上清全部被加入吸附柱。

7.可选步骤：向吸附柱中加入 10ml去蛋白液 PD，室温 12,000xg离心 1min，弃滤液。

8.加入 10ml漂洗液 WB，室温 12,000xg离心 1min，弃滤液。

（注意：漂洗液 WB为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

9.重复步骤 8一次。

10.室温 12,000xg离心 2min，甩干膜上残留乙醇。打开盖子室温晾干 2– 3min。

（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）

11.将吸附柱置于一个新的 50ml离心管（自备）中，加入 0.6- 1ml的洗脱缓冲液EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 2 min，离心管底溶液即质粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1min收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH调整其 pH值在 7.0 - 8.5 之间。）