HiPure Yeast Plasmid Mini Kit

酵母高纯度质粒小量快速提试剂盒

酵母高纯质粒小提试剂盒(离心柱型)核酸提取

目录号：31016

保存条件：

在室温(15~ 25℃)干燥条件下，可保存 12个月。加入RNaseA后的溶液P1应置于 2 ~ 8℃保存，可稳定保存 6 个月,如果 P1 中 RNase A 失活，重新补加即可。

本试剂盒用于高纯度酵母质粒 DNA的小量制备。菌体经碱裂解、高盐、低 pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心吸附柱吸附。通过清洗液的洗涤可去除杂质，在低盐、高 pH条件下洗脱，最后得到纯度较高的质粒 DNA。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、RT-qPCR、测序及转染等分子生物学实验。

1.通常酵母的拷贝数都很低，高拷贝最大得率一般为每 5 ml培养物提取 1μg左右的质粒。用于下游试验时通常建议使用量为： 1-5μl用做 PCR模板;5-10μl用于转化大肠杆菌,选择高效率的感受态细胞。

2.用户需要自备 Sorbitolbuffer( 1M山梨chun， 0.1MNa2EDTA，14mMβ-巯基乙醇)。配制方法：在 600ml去离子水里面溶解 182.2克山梨chun，加入 200 ml 0.5 M Na2EDTA(pH 8.0)，不需要调节 PH值，定容到 1L，4℃保存。临用前加 0.1%β-巯基乙醇(商品化的 β-巯基乙醇摩尔浓度一般为 14M)。

3.使用前请先检查平衡液、溶液 YP2和溶液 YP3是否出现浑浊，如有混浊现象，可在 37℃

水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。

4.溶液YP1，YP2和YP3的用量比例，若细菌量增大，需按比例放大这些溶液的使用量；重要提示：

一、第一次使用前请先漂洗液 WB中加入无水乙醇（详见瓶身标签），混匀，并做好标记。二、shou次使用时请先将 RNaseA全部加到溶液 YP1中，混匀，每次使用后置于 2~8℃保存。三、吸取使用量的Sorbitol buffer 加入 0.1%β-巯基乙醇，回复到室温备用。

1.取 1.5-5 毫升酵母培养物(不超过 5x107cells)，9,000rpm 离心 30 秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

（注意： 如果用 50ml离心管收集菌体，可以离心弃上清后，在同一管内加入更多的菌液，

重复步骤 1，直到收集到足够多的菌体）

2.加入 600μlSorbitolbuffer，轻柔吹打充分重悬细胞；可按照 20-50U/1x107cells的比例加入 Lyticase(一般 5ml培养物可能需要加到 200U)，充分颠倒混匀，37℃温育至少 30分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

（注意：如果破壁效果不好导致质粒产量低，可以加大 lyicase用量来提高酶工作浓度，还可以延长消化时间来提高效果，不适合 Lyticase消化的酵母可选用 Zymolase或者其它方法如玻璃珠涡旋，反复冻融等。）

3.13,000rpm离心 1min，尽可能吸弃上清，加入 250ul溶液YP1，重悬菌体沉淀，涡旋

震荡至che底悬浮。

（注意：如有未che底悬浮的菌块会影响裂解，导致提取的质粒浓度及纯度降低）

4.加入 250ul溶液YP2，温和地上下翻转 6-8次，使菌体充分裂解，室温放置 4min。

（注意：不可剧烈震荡，以免造成基因组DNA片段的污染，所用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏，如未wan全变得清亮，可能是菌体太多，可增加溶液P2的用量，在后续的操作中溶液YP3的用量也要相应增加）

5.加入 350ul溶液 YP3，立即温和地上下翻转 6-8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀，

然后室温 13,000rpm离心 10min。

（注意：加入溶液 YP3后应立即混合，避免产生 SDS的局部沉淀）

6.将上清液转移到吸附柱中，室温 12,000rpm离心 1min，质粒被吸附在膜上，弃滤液。

7.可选步骤：向吸附柱中加入 500ul去蛋白液 PE，室温 12,000rpm离心 1min，弃滤液。

（注意：去蛋白液 PE为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

（注意：如果宿主菌是 endA-，如 DH5α，此步骤可省略。如果宿主菌是 endA+，如 TG1、BL21、 HB101、JM101等，此步骤不可省略，因这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒。如果提取低拷贝质粒也推荐采用此步骤）

8.加入 600ul漂洗液 WB，室温 12,000rpm离心 30sec，弃滤液。

（注意：漂洗液 WB为浓缩液，按要求加入无水乙醇，用后应立即盖紧瓶盖，以防酒精挥发）

9.重复步骤 8一次。

10.室温 12,000rpm离心 2min，甩干残留液体。

（注意：此步不能省略，否则残留乙醇会影响质粒的后续使用）

11.将吸附柱置于一个新的 1.5ml离心管（自备）中，加入 50~100ul的洗脱缓冲液 EB，室温放置 2 min，12,000 rpm 离心 1 min，离心管底溶液即质粒 DNA。

（注意：事先在 65~70℃水浴中预热洗脱缓冲液 EB，可增加洗脱效率；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入吸附柱中，再次离心 1min收集；如需使用去离子水洗脱，可用 NaOH调整其 pH值在 7.0 - 8.5之间。）

酵母高纯质粒小提试剂盒(离心柱型)核酸提取